北海道大学、ヒアルロン酸オリゴ糖の同時定量法開発に初成功

北海道大学は18日、同大学大学院薬学研究院の菅原満教授、佐藤夕紀講師、北海道大学大学院生命科学院修士課程（研究当時）の髙林直央氏らの研究グループが、LC-MS／MS（液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法）により、血漿中の微量なヒアルロン酸オリゴ糖4、6、8糖を同時定量する方法を開発したことを発表した。

この研究成果は、4月24日公開の「Food Research International」誌にオンライン掲載されている。

ヒアルロン酸はD-グルクロン酸とN-アセチル-D-グルコサミンから構成されるグリコサミノグリカンの一種で、生体内での分子量は幅広い。その生体内作用も多岐にわたり、医薬品や化粧品、食品、食品添加物として用いられるなど、幅広い分野で注目を集めてきた。

食品などで経口的に摂取した場合の体内動態は不明な点が多かったが、近年、摂取したヒアルロン酸のサイズにかかわらず、腸内細菌で8糖以下のオリゴ糖に分解され、吸収されることが報告された。

生体内でのヒアルロン酸定量には、様々な方法が用いられてきたが、操作が簡便なELISA法では10糖以上の分子にしか反応せず、HPLC法では各オリゴ糖を2糖まで酵素分解して個別に測定されている。しかし、このHPLC法でも感度が十分でないという課題があった。

そこで研究グループでは、8糖以下のヒアルロン酸オリゴ糖を、簡便な前処理で、微量濃度を測定できるよう、高い感度を保ちながら同時に検出する方法の開発に着手したという。

研究グループでは、簡便な前処理法として、マトリクス中のヒアルロン酸オリゴ糖をDMT-MMとジラール試薬Pで誘導体化し、カルボン酸ヒドラジドを形成させた。

この誘導体化ヒアルロン酸オリゴ糖について、親水系相互作用を用いた固相抽出カラムで前処理後、限外ろ過カラムを通したろ液をサンプルとした。

また、同位体ジラール試薬Pを用い、同様に誘導体化したヒアルロン酸オリゴ糖が内部標準物質となり得るかどうかも確認した。これらをペンタブロモベンジル基結合型カラムにより分離し、質量分析によってピークを検出した。

そしてそれぞれに特異的なピークを確認したのち、日本臨床化学会のガイドラインに沿ってバリデーション試験を実施、この定量法の妥当性と堅牢性の確認を行った。その後、Wistarラットに市販のヒアルロン酸製剤を経口投与し、経時的に血液サンプルを得て、開発した方法によって定量、血漿中濃度の算出を試みた。

誘導体化ヒアルロン酸2、4、6、8糖のクロマトグラムを確認したところ、4、6、8糖では保持時間約3分に、2糖では約1分にそれぞれ特異的でシャープなピークを確認することができた。

また、同位体ジラール試薬Pで誘導体化したヒアルロン酸の基準ピークイオンは、ジラール試薬Pで誘導体化したヒアルロン酸のクロマトグラムにおいて確認されなかったため、内部標準物質として使用可能なことが示唆された。

さらにこの方法により、2糖以外のヒアルロン酸4、6、8糖についてそれぞれ5－600nMで良好な直線性の検量線作成が確認され、バリデーション試験によって堅牢性と妥当性も確認されたことから、ヒアルロン酸4、6、8糖を同時定量できることが示された。

また、Wistarラットへの市販ヒアルロン酸製剤の経口投与後、経時的に採取した血液を用い、今回の方法によって血漿中濃度を測定したところ、投与約1時間後にヒアルロン酸4、6、8糖それぞれのピークが認められ、約12時間後までに消失していることも確認できた。

研究グループでは、今回の製剤にどの程度ヒアルロン酸4、6、8糖が含まれているのかを明らかにし、各オリゴ糖を経口投与することによって、ヒアルロン酸経口投与後の体内動態をより詳細に明らかにできると考えているという。

また、今回は実験動物であったが、今後はヒトの血漿中ヒアルロン酸オリゴ糖の測定に適用し、作用に関する検討結果とあわせて考察を進めることで、より効果的な製剤開発や科学的根拠に基づくヒアルロン酸の効果的利用につながることが期待されるとした。

（画像はプレスリリースより）




北海道大学　プレスリリース
https://www.hokudai.ac.jp/news/pdf/260818_pr3.pdf